胡钺梅舒雅徐侨翌胡晓婷邢顺鹏皋源何征宇李雯
上海交通大医院重症医学科
国际麻醉学与复苏杂志,,42(03):-.
DOI：10./cma.j.cn-?
基金项目
国家自然科学基金（，）；
上海市闵行区自然科学研究课题（MHZ）；
年上海市“医苑新星”青年医学人才培养资助计划［SHWSRS（）?72］
ORIGINALARTICLES
本研究通过构建机械通气相关性肺纤维化小鼠动物模型以及乳酸刺激活化肺成纤维细胞的细胞模型，分别在体内和体外研究机械通气诱导肺成纤维细胞活化，促进肺纤维化的机制，重点明确乳酸?转化生长因子?β1（TGF?β1）途径在以上过程中的重要作用。
1材料与方法
1.1 分组和处理
1.1.1 实验动物的分组和处理
6~8周龄雄性野生型C57BL/6小鼠24只。将小鼠分为2组（每组12只）：假手术组（Sham组）和机械通气组（MV组）。Sham组仅做麻醉插管处理，保持自主呼吸，MV组麻醉后使用20?G动脉套管进行经口直视气管插管，并使用小动物呼吸机以20?ml/kg潮气量和70次/min通气频率进行单次机械通气2h，造模结束后送回动物房并连续观察7d。7d后两组小鼠麻醉后无痛处死，先进行心脏采血，血液静置于促凝管10min后于4?℃、?g离心5?min后收集血清，之后左肺用0.3?ml?PBS反复灌洗3次，收集肺泡灌洗液（BALF），并取部分右肺叶置于4%多聚甲醛中固定，其余肺组织冻存于?80?℃备用。
1.1.2 人胚肺成纤维细胞的培养和分组
人胚肺成纤维细胞MRC?5，用含10%胎牛血清的MinimumEssentialMedium（MEM）培养基培养于含5%CO2、充分湿化的37?℃恒温孵育箱中。当细胞达到90%融合时，加入1.5?ml?0.25%胰酶消化2~3?min，并进行传代。将培养状态良好的细胞分为4组（每组3个孔）：PBS对照组（Con组）、1?mmol/L乳酸组（Lac1组）、10?mmol/L乳酸组（Lac10组）和20?mmol/L乳酸组（Lac20组），按照不同的分组加入外源性乳酸，于乳酸刺激MRC?5细胞24?h和72?h收集细胞和细胞培养上清液进行后续实验。根据实验结果进行进一步分组，将培养状态良好的细胞分为3组（每组3个孔）：PBS对照组（Con组）、20?mmol/L乳酸组（Lac20组）和20?mmol/L乳酸+10?mmol/L?TGF?β1受体特异性抑制剂（SB）组（Lac20+SB组），于乳酸刺激MRC?5细胞24?h后收集细胞和细胞培养上清液进行后续实验。
1.2 肺组织病理学检测
取各组造模小鼠的新鲜肺组织，4?%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片，并经H?E染色、Masson染色后显微镜下观察各组肺组织炎症细胞浸润和纤维化情况。
1.3 Western?blot法检测肺纤维化相关指标
1.3.1 肺组织中Ⅰ型胶原蛋白α1链（COL1A1）、α平滑肌肌动蛋白（α?SMA）和TGF?β1的蛋白表达水平检测
取各组造模小鼠的冻存肺组织，每管加入μl含有1%苯甲基磺酰氟溶剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，放入研磨仪，60?Hz、60?s间断研磨两次至肺组织已完全磨碎，放入预冷的离心机中4?℃、?g离心10?min后取上清置于新的EP管中，采用BCA法测定蛋白浓度。用10%的分离胶进行SDS?PAGE电泳，使用转移电泳装置在4?℃恒流?mA条件下转膜60~?min，将蛋白样品转印至PVDF膜。在室温条件下使用Western封闭液封闭PVDF膜15?min，加入用Western一抗稀释液稀释的一抗，分别为抗COL1A1抗体、抗α?SMA抗体、抗TGF?β1抗体、抗β?Tubulin抗体，4?℃孵育过夜，次日TBST漂洗后加入用Western二抗稀释液稀释的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗，室温孵育1h，TBST漂洗后加入ECL显色液，Bio?Rad显影仪进行显色反应。显色后使用Image?lab软件对蛋白条带灰度值进行定量分析。以目的蛋白灰度值与β?Tubulin灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。
1.3.2 肺成纤维细胞中COL1A1、α?SMA和TGF?β1的蛋白表达水平检测
将MRC?5细胞以4×个/ml的密度接种于6孔培养板，待细胞汇合达到80?%时进行饥饿过夜，次日更换含PBS或不同浓度梯度乳酸的完全培养基处理72?h后，每孔加入?μl含有1%苯甲基磺酰氟溶剂、蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液裂解细胞，4?℃、?g离心10?min后取上清置于新的EP管中，以BCA法测定蛋白浓度。后续蛋白电泳测定同1.3.1。
1.4 比色法检测乳酸含量
取各组造模小鼠血清和BALF，使用乳酸检测试剂盒通过比色法对样本进行检测，具体操作步骤根据试剂盒说明书进行。
1.5 ELISA检测PICP和TGF?β1的含量
将MRC?5细胞以4×个/ml的密度接种于6孔培养板，待细胞汇合达到80%时进行饥饿过夜，次日更换含PBS或不同浓度梯度乳酸的完全培养基处理，分别于乳酸刺激MRC?5细胞24?h和72?h后收集每孔的细胞培养液上清，使用TGF?β1?ELISA检测试剂盒和PICPELISA检测试剂盒检测TGF?β1和PICP的含量，具体操作步骤根据试剂盒说明书进行。
1.6 免疫荧光技术检测α?SMA的表达情况
将MRC?5细胞接种于放置无菌盖玻片的12孔细胞培养板中，密度8×个/ml，经PBS或乳酸处理24?h后，用4%多聚甲醛固定细胞10?min，用0.5%?TritonX?穿膜10min，室温封闭1?h，加入α?SMA一抗，4?℃过夜，次日PBS洗去一抗，加入FITC标记的山羊抗兔二抗避光室温孵育1?h，然后用含有4,6?二脒基?2?苯基吲哚（DAPI）核染料的封片剂进行封片。置于荧光显微镜下观察和拍照，此过程注意避光。
2结 果
2.1 机械通气诱发肺纤维化的形成
与Sham组比较，MV组小鼠肺组织H?E染色显示肺泡完整性破坏，肺泡壁增厚，大量中性粒细胞浸润。Masson染色显示MV组小鼠肺组织纤维化加重（图1）。Western?blot法检测结果表明，与Sham组比较，MV组小鼠肺组织COL1A1和α?SMA的表达水平增加（P0.05，图2）。
2.2 机械通气促进肺组织乳酸积聚和TGF?β1表达
与Sham组比较，MV组血清和BALF中的乳酸含量升高，肺组织TGF?β1表达水平增高（P0.05，图3）。
2.3 乳酸促进TGF?β1表达和肺成纤维细胞活化
乳酸刺激MRC?5细胞24?h后，Lac20组细胞培养液上清中TGF?β1较Con组含量升高（P0.05）；乳酸刺激MRC?5细胞72?h后，与Con组比较，Lac1组差异无统计学意义（P0.05），但随着乳酸浓度增加，Lac10组和Lac20组细胞培养液上清中的PICP含量升高，COL1A1和α?SMA表达水平增加（P0.05，图4）。乳酸刺激MRC?5细胞24h后，Lac20组比Con组的α?SMA表达有所增加（图5）。
2.4 抑制TGF?β1受体可以减轻乳酸的致肺成纤维细胞活化效应
TGF?β1受体特异性抑制剂SB处理20?mmol/L乳酸刺激的MRC?5细胞24h后，与Con组比较，Lac20组COL1A1和α?SMA表达水平增加（P0.05），与Lac20组比较，Lac20+SB组COL1A1和α?SMA表达水平下降（P0.05）。见图6。
3讨 论
研究机械通气相关性肺纤维化的发病机制，在患者接受机械通气的早期进行及时干预而阻断肺纤维化进程，有助于提高接受机械通气重症患者的生存率，对于改善患者预后和减轻社会医疗负担具有重要意义，是重症医学研究领域所面临的重要科学问题。
本研究在动物模型水平观察到机械通气在引起肺纤维化的同时会导致乳酸升高，而在细胞水平发现乳酸可以直接活化肺成纤维细胞，进一步说明了乳酸在机械通气相关性肺纤维化发病过程中具有重要作用。此外，本课题组前期研究证实，脓毒症过程中肺组织的有氧酵解过程可引起乳酸分泌，而机械通气过程中是否存在肺组织有氧酵解增强值得进一步研究。
本研究在动物模型水平发现机械通气引起乳酸升高的同时伴有肺组织TGF?β1的升高，而在体外细胞研究过程中发现外源性乳酸刺激可以引起细胞培养液上清中TGF?β1的升高以及肺成纤维细胞的活化，使用TGF?β1受体特异性抑制剂SB阻断TGF?β1受体后发现乳酸的促肺成纤维细胞活化效应减弱，提示乳酸可以促进TGF?β1的生成和肺成纤维细胞活化，从而在机械通气相关性肺纤维化中起到重要作用。然而，本研究中乳酸通过何种机制引起TGF?β1升高尚不明确。
本研究发现，机械通气可以促进小鼠肺组织乳酸积聚，而加入外源性乳酸可以通过TGF?β1途径促进肺成纤维细胞活化。因此，机械通气过程中乳酸?TGF?β1途径的活化可能是肺成纤维细胞活化以及机械通气相关性肺纤维化进展的重要环节。深入研究机械通气过程中乳酸?TGF?β1途径活化的相关机制，有助于为机械通气相关性肺纤维化防治途径的探索奠定理论基础，对于探索肺纤维化的发病机制具有重要意义。本研究采用大潮气量机械通气动物模型的目的是评价机械牵张力对于肺成纤维细胞活化的影响，提示机械牵张微环境的变化可能是机械通气相关性肺纤维化发生的重要原因，尚有待进一步研究评价不同潮气量对肺成纤维细胞活化的影响以完整阐明机械通气相关性肺纤维化发生的机制。
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