探秘肺器官高清实质细胞图谱

肺司呼吸，是人体最重要的器官之一，对肺部以及呼吸道细胞组成、功能的研究是攻克肺部疾病和肺癌发生发展的重要前提。肺从组织学角度可粗略划分为气管、支气管、细支气管以及肺泡结构，不同区域由不同的细胞类型组成，维持着正常肺部的结构和功能。伴随着疾病的发生，细胞的增殖、发育会发生明显的变化，传统气道实质细胞的组成已经不能够满足疾病基础研究需要。近年来，随着以单细胞转录组测序为首的新兴科学技术的出现，一些肺部罕见的细胞类型逐步被挖掘出来。单细胞分辨率下的肺部景观以新识别的细胞类型和不同的细胞生物学状态为特征，并且根据解剖学位置和疾病的出现而存在差异。本期科普推文为大家解析一个高清的肺器官细胞学图谱。

成人呼吸系统

呼吸系统是一个复杂的器官系统，分为上呼吸道和下呼吸道，其中上呼吸道包括鼻腔、咽、喉，下呼吸道包括导气道(气管、支气管、细支气管)和呼吸区(呼吸细支气管、肺泡)。肺属于下呼吸道，是呼吸系统最重要的器官，根据解剖和功能特点，肺可进一步划分为三个上皮结构域，分别为近端软骨气道(气管和支气管)、远端气道(细支气管、终末细支气管和呼吸型细支气管)以及气体交换空间(肺泡)[1]。

图1.人呼吸道结构

健康人肺细胞的组成及功能

为了满足肺区域功能的需要，导气管各区域分布着不同类型的上皮细胞。近端气道由假复层柱状上皮细胞排列，主要包括基底细胞(basalcells)、棒状细胞(Clubcells)、纤毛细胞(ciliatedcells)和杯状细胞(Gobletcells)；在远端气道(细支气管)中，棒状细胞、纤毛细胞、神经内分泌细胞(Neuroendocrinecells)是主要的细胞群体；终末细支气管连接的肺泡上皮由立方型肺泡细胞(AT2)和鳞状气体交换型肺泡细胞(AT1)组成[2]。近年来随着单细胞转录组测序技术的兴起，一些罕见细胞类型，如刷状细胞(Brushcells)、离子细胞(ionocytes)等也逐步被发现[3]。

图2.成年人肺部结构

1、基底细胞

基底细胞是成人气道重要的祖细胞，主要分布在近端气道，负责稳态和损伤修复。基底细胞可分化为近端气道中的所有上皮细胞类型，包括纤毛细胞、杯状细胞和棒状细胞以及它自身[4]。角蛋白5(KRT5)、角蛋白14(KRT14)和水通道蛋白3(AQP3)可用于基底细胞的鉴定和分离。

2、纤毛细胞

纤毛细胞是气道上皮的优势细胞群体，至少占气道上皮细胞的50%，主要由基底细胞和分泌祖细胞(如Clubcells)分化而来，在纤毛细胞发生的转录调控网络中，FOXJ1发挥着核心作用。每个纤毛细胞约有多根纤毛，用于粘液的清除，粘液纤毛清除是一种基本的防御机制，需要杯状细胞和纤毛细胞的合作[5]。

3、杯状细胞

产生粘液的杯状细胞在近端气道中的比例约为5%-15%，而远端气道中几乎没有。杯状细胞呈高脚杯状，也是由基底细胞和棒状细胞分化而来，来自粘膜下腺导管和气道的杯状细胞可分泌粘蛋白，杯状细胞的数量及其粘蛋白、固有防御分子的分泌与环境的刺激高度相关。MUC5AC和MUC5B是杯状细胞分泌的主要粘蛋白，在肺部先天免疫反应中起着直接作用，可招募树突细胞、天然淋巴细胞和嗜酸性粒细胞，进而响应外界环境的刺激[5]。

4、棒状细胞

棒状细胞又叫Claracells，是一种柱状的分泌细胞，其数量在气道的各个位置中有所不同，在生理条件下，棒状细胞约占人类肺部上皮细胞总数的9%。而在小鼠气道中有几乎相同数量的纤毛细胞和棒状细胞，这与人和灵长类动物中相对稀少的棒状细胞形成鲜明对比。约11%-22%的棒状细胞位于终末细支气管，在近端支气管粘膜中几乎没有分布。棒状细胞高表达细胞色素P-、解毒酶CYP2F和天然免疫蛋白，包括SCGB1A1、SCGB3A1等。当受到外界环境刺激时，棒状细胞可增殖分化为杯状或纤毛细胞，以响应肺部损伤和其他环境信号[6]。

5、神经内分泌细胞

肺神经内分泌细胞(PNECs)是一种罕见的具有独特神经和内分泌特性的气道上皮细胞，大约占人气道上皮细胞的1%左右，通常位于气道分支点附近。一些体外实验表明，PNECs通过释放神经肽和神经递质来响应化学或机械刺激，充当氧、二氧化碳和其他环境刺激的传感器。PNECs通过表达不同的肽和化学标记物来识别，包括降钙素基因相关肽(CGRP)、血清素、胃泌素释放肽等。Ouadah等人利用scRNA-seq鉴定了一组以Notch2为标记的PNECs，该细胞可在损伤后去分化，再分化为其他类型的气道上皮细胞[7]。

图3.PNECs亚型聚类

6、刷状细胞

刷状细胞，也叫Tuftcells，见于多个器官，如气管、胰腺和肠道。虽然气道刷状细胞的功能尚不清楚，但最近来自肠道研究的证据描述了这些细胞在感知微生物和寄生虫中的重要作用，肠Tuftcells可作为“味觉”传感器，对蠕虫和寄生虫释放的细胞产物作出反应。刷状细胞分泌的IL-25可招募并激活ILC2先天免疫细胞，进而影响IL-13和其他细胞因子的产生，这些细胞因子是寄生虫从肠道排出所必需的。呼吸道刷状细胞的先天免疫功能是否影响慢性肺部疾病的发生发展将是进一步研究的热点[4]。

7、AlveolartypeIcells(AT1)

成人的肺中，大约有3亿个肺泡，这些肺泡提供了足够大的面积用于气体交换。鳞状AT1细胞与肺微循环毛细血管内皮细胞紧密结合形成表面积广阔的气体交换区域，氧和二氧化碳在AT1上皮细胞与毛细血管内皮细胞之间进行着高效交换；在成熟的肺中，肺泡表面主要由AT1细胞组成(约占表面积的95%)，其余的被AT2细胞覆盖，但AT2的细胞数量却是AT1的约2倍[8]。Wang等人发现AT1细胞包括HOPX+/IGFBP2+和HOPX+/IGFBP2-两种亚型，其中HOPX+/IGFBP2-亚群保持细胞可塑性、可增殖并转分化为AT2细胞，是损伤后组织再生的细胞群体[9]。

8、AlveolartypeIIcells(AT2)

AT2细胞产生肺表面活性剂脂类，主要是磷脂酰胆碱和表面活性剂蛋白(SFTPA、SFTPB、SFTPC和SFTPD)，它们可以降低肺泡表面张力，防止呼吸周期中产生肺不张现象[4]。在胚胎晚期，AT1和AT2细胞从肺泡祖细胞分化形成远端肺泡囊，同样作为肺泡祖细胞的AT2细胞，可在肺泡稳态和损伤修复过程中分化为AT1细胞[9]。研究发现，当AT2细胞的正常功能受损，会发展为促纤维化表型，将有助于特发性肺纤维化(Idiopathicpulmonaryfibrosis，IPF)的发生[10]。JeffreyA.Whitsett等人对小鼠正常以及IPF样本进行scRNA-seq，在正常样本中AT2是主要的细胞类型，而在IPF样本中发现了一群类似于AT2的上皮细胞，同时表达其它气道上皮细胞的标记基因，追溯了IPF发生的细胞来源[11]。早在20年前J.H.Dljkman等人就研究过AT2细胞与肺癌形成的关系，结果证明AT2细胞是一种参与人类腺癌和鳞状细胞癌发生的多能干细胞，并且推测正常AT2细胞是肿瘤干细胞的来源之一[12]。Desai等人也曾报道过AT2细胞可作为祖细胞，在各种类型的肺损伤中变得活跃并增殖，推测AT2是驱动肺癌的细胞来源[9]。

9、离子细胞

JayarajRajagopal等人通过对小鼠数千个气道上皮细胞(取自整个气管)进行scRNA-seq，绘制了详细的呼吸道细胞分子图谱，除了得到常见的上皮细胞亚群之外，还发现了一群新的细胞类型:Foxi1+肺离子细胞(约占0.01%)，该亚群特异表达囊性纤维化跨膜电导调节因子Cftr，可能在囊性纤维化疾病中发挥作用。另外，通过对杯状细胞和tuftcells亚型分析，发现了可能与哮喘等疾病相关的细胞亚型[13]。

图4.小鼠气管上皮细胞的单细胞表达图谱

单细胞测序揭秘肺癌发生

scRNA-seq精确鉴定细胞类型的优势，被广泛应用于肺癌研究中。Kim等人对44例未接受治疗的LUAD支气管样本进行scRNA-seq，通过对比正常上皮细胞和肿瘤细胞，描述了腺癌细胞的内在特征。在肿瘤组织中，作者结合了基因组拷贝数变异(CNVs)，精确分离了肿瘤细胞；对各亚群进一步研究发现，大多数肿瘤细胞表现出与分泌细胞、肺泡细胞类似的分子特征，并表现出增殖、凋亡等明显的肿瘤信号特征[14]。

图5.LUAD中癌细胞特征

目前仍不清楚肿瘤如何从单个细胞进化为恶性的异质性组织。TuomasTammela团队对小鼠肺肿瘤组织进行scRNA-seq，详细描述了从肿瘤前增生到腺癌形成的不同阶段，发现了一种癌细胞状态——“高可塑性癌细胞状态”(HPCS)，表现出胚胎滋养层干细胞、软骨干细胞，甚至肾脏细胞的特征。HPCS几乎可分化成肿瘤中出现的所有异质性恶性细胞，可能是克服肿瘤耐药性的一个非常有潜力的治疗靶标[15]。

图6.scRNA-seq描述腺癌形成的过程

单细胞测序助力肺癌免疫治疗

近些年肺癌在靶向治疗以及免疫治疗方面取得了突破进展，部分患者的生存率得到显著提升，但对于大多数患者，耐药性是一个巨大挑战。scRNA-seq能够精密窥探肿瘤微环境中的分子表征，探索耐药机制，发现新的突变位点，设计新的药物靶点。

TreverG.Bivona等对来自接受靶向治疗前后的患者样本进行了scRNA-seq，与非癌细胞相比，癌细胞表达了更多的独特基因，并且鉴定出临床已知的致癌驱动突变基因，特别的是，在其中的1例样本中检测到一个隐匿性基因突变，该样本来源于多种疗法治疗后的患者，提示多种耐药机制的进化。通过对不同治疗阶段患者的基因表达水平进行深入对比，发现复发阶段犬尿氨酸途径特征基因(IDO1/KYNU/QPRT)表达上调，该途径可能通过诱导肿瘤免疫抑制，影响治疗效果，提示IDO1可作为潜在的治疗靶标[16]。

图7.scRNA-seq推断患者的突变状态

单细胞转录组测序技术的出现为人们重新认识肺部发育，以及为研究肺部疾病打开了新的大门，从绘制肺细胞全景图谱到研究疾病、肿瘤发生发展乃至疗效评估和新靶点发现，scRNA-seq技术在各个环节都展示出了它的优势。新格元生物科技有限公司致力于单细胞转录组测序产品的自主研发，有着非常丰富的肺部特别是肺癌项目研究经验。新格元搭建了全球领先水平的单细胞数据库SynEcoSys?，为单细胞测序数据挖掘和临床意义解读保驾护航。通过关联基因层面和细胞层面的公共数据库、单细胞公共数据集、疾病和药物靶点信息，快速高效的提供从数据到临床意义的发现和解读。相信在新兴科学技术的帮助下，人们定能早日解锁癌症密码。

参考文献

[1]RichardJ.,ClareM.Regulationofimmuneresponsesbytheairwayepithelialcelllandscape.NatRevImmunol().

[2]NasserK.Altorki,GeoffreyJ.Markowitz,DingchengGao,JeffreyL.Port,AshishSaxena,BrendonStiles,TimothyMcGraw,VivekMittal.Thelungmicroenvironment:animportantregulatoroftumourgrowthandmetastasis.NatRevCancer().

[3]LindseyW.Plasschaert,Rapolas?ilionis,RaymanChoo-Wing,VirginiaSavova,JudithKnehr,GuglielmoRoma,AllonM.Klein,AronB.Jaffe.Asingle-cellatlasoftheairwayepitheliumrevealstheCFTR-richpulmonaryionocyte.Nature,pages–().

[4]JeffreyA.Whitsett,TanyaV.Kalin,YanXu,andVladimirV.Kalinichenko.Buildingandregeneratingthelungcellbycell.PhysiolRev99:–().

[5]SophieGohy,Fran?oisM.Carlier,ChantalFregimilicka,BrunoDetry,MarylèneLecocq,MahaZohraLadjemi,StijnVerleden,DelphineHoton,BirgitWeynand,CarolineBouzin,CharlesPilette.AlteredgenerationofciliatedcellsinchronicobstructivepulmonaryDisease.ScientificReports9:().

[6]WojciechRokicki,MarekRokicki,JacekWojtacha,AgataD?eljijli.Theroleandimportanceofclubcells(Claracells)inthepathogenesisofsomerespiratorydiseases.KardiochirurgiaiTorakochirurgiaPolska.13(1):26-30().

[7]Ouadah,Y.,Rojas,E.R.,Riordan,D.P.,Capostagno,S.,Kuo,C.S.,Krasnow,M.A.RarepulmonaryneuroendocrinecellsarestemcellsregulatedbyRb,p53,andNotch.Cell,–.e23().

[8]EwaldR.Weibel.Lungmorphometry:thelinkbetweenstructureandfunction.CellTissueRes.()

[9]YanjieWanga,b,ZanTangb,c,HuanweiHuangb,JiaoLib,d,ZhengWangb,e,YuanyuanYua,b,ChengweiZhangf,JuanLib,HuapingDaig,FengchaoWangb,TaoCaib,NanTang.PulmonaryalveolartypeIcellpopulationconsistsoftwodistinctsubtypesthatdifferincellfate.ProcNatlAcadSciUSA–().

[10]TanyalakParimon,ChangfuYao,BarryRStripp,PaulWNoble,PeterChen.AlveolarEpithelialTypeIICellsasDriversofLungFibrosisinIdiopathicPulmonaryFibrosis.Int.J.Mol.Sci.21,().

[11]YanXu,TakakoMizuno,AnushaSridharan,YinaDu,MinzheGuo,JieTang,KathrynA.Wikenheiser-Brokamp,Anne-KarinaT.Perl,VincentA.Funari,JasonJ.Gokey,BarryR.Stripp,JeffreyA.Whitsett.Single-cellRNAsequencingidentifiesdiverserolesofepithelialcellsinidiopathicpulmonaryfibrosis.JCIInsight.1(20)().

[12]A.W.TenHave-Opbroek,J.R.Benfield,J.H.J.H.vanKrieken,J.H.Dljkman.ThealveolartypeIIcellisapluripotentialstemcellinthegenesisofhumanadenocarcinomasandsquamouscellcarcinomas.HistolHistopathol12:-().

[13]MontoroDT,HaberAL,BitonM,VinarskyV,LinB,BirketSE,YuanF,ChenS,LeungHM,VilloriaJ,RogelN,BurginG,RegevA,RajagopalJ.ArevisedairwayepithelialhierarchyincludesCFTR-expressingionocytes.Nature.08;()().

[14]NayoungKim,HongKwanKim,KyungjongLee,YouraeHong,JongHoCho,JungWonChoi,Jung-IlLee,Yeon-LimSuh,BoMiKu,Myung-JuAhn,Hae-OckLee.Single-cellRNAsequencingdemonstratesthemolecularandcellularreprogrammingofmetastaticlungadenocarcinoma.NATURECOMMUNICATIONS.11:().

[15]MarjanovicND,HofreeM,ChanJE,CannerD,WuK,TrakalaM,HartmannGG,SmithOC,KimJY,EvansKV,HudsonA,TammelaT.EmergenceofaHigh-PlasticityCellStateduringLungCancerEvolution.Cancercell.;38(2)().

[16]MaynardA,McCoachCE,RotowJK,HarrisL,HaderkF,KerrDL,YuEA,SchenkEL,TanW,ZeeA.Therapy-InducedEvolutionofHumanLungCancerRevealedbySingle-CellRNASequencing.Cell03;(5)().

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